|
|
Preparation, expression and characterization of mouse GCPIII
Bäumlová, Adriana ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Šebo, Peter (oponent)
Slovenský abstrakt Glutamátkarboxypeptidáza II (GCPII, EC 3.4.17.21) je transmembránovým glykoproteínom II typu, ktorý bol objavený v nervovom systéme na základe degradácie N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamatu na N-acetyl-L-aspartát a L-glutamát, a preto sa predpokladá jeho účasť na nervovej signalizácií. Okrem mozgu, GCPII bola objavená vo väčšej miere taktiež v prostate, obličkách a tenkom čreve. V tenkom čreve GCPII napomáha vstrebávaniu folátov z potravy tým, že odštepuje koncové glutamáty z polyglutamylovaných folátov. V prostate nie je funkcia tohto proteínu doposiaľ známa, avšak využíva sa ako márker rakoviny. Mus musculus je dôležitým modelom pre štúdium GCPII a jej homológov ako terapeutického ciela. Ľudská GCPII a jej paralóg GCPIII sú pomerne dobre charakterizované, zatiaľ čo žiadna biochemická štúdia o ich myších ortológoch nie je dostupná. Preto sme myšaciu glutamátkarboxypeptidázu III (mGCPIII) naklonovali, pripravili rekombinantnou expresiou v hmyzích bunkách a chrakterizovali. Ukázali sme, že mGCPIII vykazujeα-glutamátkarboxypeptidázovú aktivitu, ktorá je inhibovatelná špecifickým inhibítorom GCPII, 2-PMPA. Taktiež sme testovali citlivosť a špecifitu monoklonálnych protilátok voči myšacej GCPIII. Imunochemická detekcia odhalila, že protilátka GCP-04 rozpoznáva ľudskú GCPII rovnako dobre ako...
|
|
|
Příprava glutamátkarboxypeptidasy III v savčím expresním systému
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Role glutamátkarboxypeptidasy II v savčím organismu je již poměrně dobře prozkoumaná, avšak o jejím homologu - glutamátkarboxypeptidase III - je známo jen minimum informací. Pro strukturní a funkční charakterisaci proteinu je zapotřebí velké množství proteinu, který je možno získat expresí v tkáňových kulturách. Vlastnosti proteinu mohou být ovlivněny posttranslačními mo- difikacemi, přičemž různé organismy provádějí různé posttranslační modifikace. Proto jsme se rozhodli vyvinout systém pro produkci rekombinantního GCPIII v savčích buňkách. Nejprve byl zaveden savčí expresní systém HEK 293-6E jako náhrada dosavadního hmyzího ex- presního systému. Výhodou tohoto savčího expresního systému je jeho snadná kultivace v suspenzních podmínkách a možnost transientní transfekce. Dále byly optimalizovány transfekční podmínky pro tento systém pomocí exprese zeleného fluorescenčního proteinu, pro snadnou detekci pomocí průtokové cyto- metrie. DNA kódující extracelulární část myší GCPIII (mEXSTII) byla klonována do pěti různých expres- ních plasmidů s použitím různých značek pro afinitní chromatografii (polyhistidinová kotva nebo tzv. Fc značka) na N- nebo C-konci připravovaného proteinu. Připravenými plasmidy byly transfekovány buňky. Pomocí imunochemické detekcce byla v médiích testována přítomnost...
|
|
|
Development of analytical tools for quantification and screening for inhibitors of glutamate carboxypeptidases II and III
Navrátil, Václav ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Šedo, Aleksi (oponent)
Glutamát karboxypeptidasa II (GCPII), známá také jako prostatický specifický membránový antigen (PSMA), je membránová metalopeptidasa exprimovaná zejména na buňkách karcinomu prostaty (PCa). Látky cílící GCPII pro zobrazování a léčbu PCa jsou ve vývoji a ukazují nadějné výsledky v pokročilých fázích klinického testování. Některé studie ukázaly, že GCPII by mohla být využita také jako krevní marker PCa, což ale zatím nebylo potvrzeno kvůli absenci metod vhodných pro přesnou detekci GCPII v krvi. GCPII je exprimována také v mozku, kde štěpí inhibiční N-Acetyl-α-L-aspartyl-L- glutamát (NAAG) na excitační L-glutamát a inhibice GCPII je neuroprotektivní ve zvířecích modelech několika neuropatií. Silné inhibitory GCPII byly nalezeny pomocí racionálního vývoje, ale všechny vykazují nedostatečnou biodostupnost aby mohly být využity v klinické praxi. Nalezení nových strukturních motivů je tedy nezbytné, nicméně zatím nebyla vyvinuta žádná metoda vhodná pro účinné testování inhibitorů GCPII. V mozku se nalézá také málo prozkoumaná glutamát karboxypeptidasa III (GCPIII), která také štěpí NAAG. Její studium je tak nutné pro pochopení funkce GCPII a pro cílení GCPII v medicíně. V této práci jsme se zaměřili na vývoj nových metod pro kvantifikaci obou enzymů a pro hledání jejich inhibitorů. Nejprve jsme vyvinuli...
|
|
|
Příprava glutamátkarboxypeptidasy III v savčím expresním systému
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Role glutamátkarboxypeptidasy II v savčím organismu je již poměrně dobře prozkoumaná, avšak o jejím homologu - glutamátkarboxypeptidase III - je známo jen minimum informací. Pro strukturní a funkční charakterisaci proteinu je zapotřebí velké množství proteinu, který je možno získat expresí v tkáňových kulturách. Vlastnosti proteinu mohou být ovlivněny posttranslačními mo- difikacemi, přičemž různé organismy provádějí různé posttranslační modifikace. Proto jsme se rozhodli vyvinout systém pro produkci rekombinantního GCPIII v savčích buňkách. Nejprve byl zaveden savčí expresní systém HEK 293-6E jako náhrada dosavadního hmyzího ex- presního systému. Výhodou tohoto savčího expresního systému je jeho snadná kultivace v suspenzních podmínkách a možnost transientní transfekce. Dále byly optimalizovány transfekční podmínky pro tento systém pomocí exprese zeleného fluorescenčního proteinu, pro snadnou detekci pomocí průtokové cyto- metrie. DNA kódující extracelulární část myší GCPIII (mEXSTII) byla klonována do pěti různých expres- ních plasmidů s použitím různých značek pro afinitní chromatografii (polyhistidinová kotva nebo tzv. Fc značka) na N- nebo C-konci připravovaného proteinu. Připravenými plasmidy byly transfekovány buňky. Pomocí imunochemické detekcce byla v médiích testována přítomnost...
|
|
|
Human glutamate carboxypeptidases II and III
Navrátil, Michal ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Zde presentovaná doktorská disertační práce popisuje kinetickou a strukturní characterisaci lidských glutamátkarboxypeptidas II a III (GCPII a GCPIII) za použití jejich přirozených substrátů. Tyto enzymy odštěpují C-koncový glutamát z jejich substrátů. Proteiny sdílejí 67 % sekvenční identitu a také podobné enzymové aktivity. Tato disertační práce kvantitativně porovnává lidskou GCPII a GCPIII co se týče jejich schopnosti hydrolysovat endogenní substráty N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamát (NAAG), folyl-poly-γ-L- glutamové kyseliny (FolGlun) a β-citryl-L-glutamát (BCG). Prokázali jsme, že hydrolysa těchto substrátů pomocí GCPIII je závislá na přítomnosti kationtů kovů, že BCG je specifický substrát GCPIII, a že NAAG a FolGlun jsou specifické substráty GCPII. Rovněž přinášíme nepřímé biochemické důkazy o tom, že GCPIII by mohla mít v aktivním místě heterometalický klastr. Také jsme charakterisovali relevanci povrchového vazebného místa v GCPII, takzvaného aromatické skupiny vázajícího místa (ASVM), pro hydrolysu FolGlun substrátů za použití metody cílené mutagenese basí DNA a enzymové kinetiky a ukázali jsme, že polymorfní varianta GCPII His475Tyr hydrolysuje substráty FolGlun se stejnými kinetickými parametry jako divoký typ. Dále se tato disertační práce se zaměřuje na strukturní aspekty substrátových...
|
|
|
Preparation, expression and characterization of mouse GCPIII
Bäumlová, Adriana ; Šebo, Peter (oponent) ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce)
Slovenský abstrakt Glutamátkarboxypeptidáza II (GCPII, EC 3.4.17.21) je transmembránovým glykoproteínom II typu, ktorý bol objavený v nervovom systéme na základe degradácie N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamatu na N-acetyl-L-aspartát a L-glutamát, a preto sa predpokladá jeho účasť na nervovej signalizácií. Okrem mozgu, GCPII bola objavená vo väčšej miere taktiež v prostate, obličkách a tenkom čreve. V tenkom čreve GCPII napomáha vstrebávaniu folátov z potravy tým, že odštepuje koncové glutamáty z polyglutamylovaných folátov. V prostate nie je funkcia tohto proteínu doposiaľ známa, avšak využíva sa ako márker rakoviny. Mus musculus je dôležitým modelom pre štúdium GCPII a jej homológov ako terapeutického ciela. Ľudská GCPII a jej paralóg GCPIII sú pomerne dobre charakterizované, zatiaľ čo žiadna biochemická štúdia o ich myších ortológoch nie je dostupná. Preto sme myšaciu glutamátkarboxypeptidázu III (mGCPIII) naklonovali, pripravili rekombinantnou expresiou v hmyzích bunkách a chrakterizovali. Ukázali sme, že mGCPIII vykazujeα-glutamátkarboxypeptidázovú aktivitu, ktorá je inhibovatelná špecifickým inhibítorom GCPII, 2-PMPA. Taktiež sme testovali citlivosť a špecifitu monoklonálnych protilátok voči myšacej GCPIII. Imunochemická detekcia odhalila, že protilátka GCP-04 rozpoznáva ľudskú GCPII rovnako dobre ako...
|
host ::
RSS.